Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.

Abstract

Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru - M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy...

Influenza virus causes severe respiratory infections in birds and mammals and it is responsible for up to half a million deaths of human beings worldwide each year. Two molecular targets in influenza viral life cycle, neuraminidase and M2 proton channel are exploited in treatment. However, the recent emergence of new pandemic type along with increasing resistance against approved drugs has urged the need for a new drug target discovery and potential search of its inhibitor. Recently, an interesting protein-protein interaction between two subunits PA and PB1 of influenza A viral polymerase has been identified by X-ray crystallography as a new promising drug target. The fact that relatively few residues drive the binding and that the binding interface is highly conserved presents an intriguing possibility to identify antiviral lead compounds effective against all subtypes of influenza A virus. In our laboratory, we expressed and purified two fusion tag constructs of the recombinant C-terminal domain of polymerase acidic subunit (CPA) from the pandemic isolate A/California/07/2009 H1N1. First, GST-CPA fusion protein was used for kinetic evaluation of PA-PB1 interaction by surface plasmon resonance. Moreover, this construct was used in the development of high-throughput screening method for search of...