Studium molekulární organizace systému cytochromu P450

Abstract

Mixed-function oxygenase systém (MFO systém) plays a vital role in the metabolism of a variety of both endogenous substrates and xenobiotics. This membrane systém consists of cytochrome P450s, NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase (POR), cytochrome b5 and NADH:cytochrome b5 oxidoreductase (b5R). Cytochrome P450 catalyzes a monooxygenation of a substrate, while POR and cytochrome b5 represent its redox partners. Cytochrome b5, itself having a redox partner in b5R, effects the reactions catalyzed by the MFO system in various ways, through mechanisms that are not fully understood. This paper focuses on the purification of b5R and POR from rabbit liver. The microsomal fraction obtained by differential centrifugation contained 42 mg of protein per ml. From a portion of the microsomal fraction, b5R was obtained using chromatography on DEAE-Sepharose, CM-Sepharose and 5'-ADP agarose columns. The yield was 0,3 % of ferricynide-reductase activity and the product contained several contaminants in the molecular weight range of 50-70 kDa. A second purification of b5R from the microsomal fraction was carried out using a column of DEAE-Sepharose directly connected to a 5'-ADP agarose column. The b5R product was purified with a yield of 10,9 % and it once again contained several contaminants in the molecular...

V metabolismu velkého množství endogenních látek i xenobiotik hraje zásadní roli systém oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systém). Tento membránový systém je tvořen cytochromy P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasou (CPR), cytochromem b5 a NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasou (b5R). Cytochrom P450 katalyzuje monooxygenaci substrátu a CPR a cytochrom b5 představují jeho redoxní partnery. Cytochrom b5, jehož redoxním partnerem je b5R, ovlivňuje reakce katalyzované MFO systémem, a to ne zcela objasněným mechanismem. Tato práce se zabývá purifikací b5R a CPR z jater králíka domácího. Diferenční centrifugací bylo získáno 18 ml mikrosomální frakce o obsahu proteinů 42 mg/ml. Z prvního dílu mikrosomální frakce byla pomocí chromatografie na kolonách DEAE- Sepharosy, CM-Sepharosy a 5'-ADP agarosy izolována b5R s výtěžkem 0,3 % ferrikyanid- reduktasové aktivity a obsahující několik kontaminantů o molekulových hmotnostech 50-70 kDa. Při druhé purifikaci b5R byla použita kombinace chromatografie na koloně DEAE-Sepharosy s přímým napojením na kolonu 5'-ADP agarosy, z níž byla získána b5R s výtěžkem 10,9 % a obsahující rovněž několik kontaminantů v intervalu molekulových hmotností 50-70 kDa. Preparát redukoval cytochrom b5 v přítomnosti NADH. Při obou purifikacích byla rovněž získána CPR pomocí chromatografií na...