Molekulární mechanismus regulace funkce neutrální trehalasy Nth1

Abstract

Enzym neutrální trehalasa (Nth1, EC 3.2.1.28), pocházející z kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae, pomáhá těmto organismům přežít v nepříznivých životních podmínkách. Nth1 hydrolyticky štěpí zásobní a ochranný disacharid trehalosu za vzniku dvou molekul glukosy. Aktivita enzymu Nth1 je regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou (PKA), následnou vazbou kvasničného proteinu 14-3-3 (Bmh1) a pomocí kationtů Ca2+ , které se váží na Ca-vazebnou doménu. Tato doména se nachází na N-konci Nth1 a obsahuje tzv. EF-hand motiv (D114 TDKNYQITIED125 ), který je konzervovaný mezi velkým množstvím Ca-vazebných proteinů. Hlavním cílem tohoto projektu bylo objasnění molekulární a strukturní podstaty mechanismu regulace aktivity Nth1 prostřednictvím vazby kationtů Ca2+ a proteinu Bmh1. Dalšími cíli bylo vyřešení struktury samotné Nth1 a jejího komplexu s Bmh1. Pro výzkum úlohy kationtů Ca2+ v regulaci aktivity Nth1 bylo připraveno dvanáct mutantních forem Nth1 s cílenými bodovými mutacemi v oblasti tzv. EF-hand motivu a jeho blízkém okolí a následně byla stanovena jejich aktivita v závislosti na přítomnosti Bmh1 a/nebo kationtů Ca2+ . Tvorba stabilních komplexů fosforylované pNth1 (včetně mutantních forem) s proteinem Bmh1 byla potvrzena pomocí nativní polyakrylamidové gelové...

The yeast enzyme neutral trehalase (Nth1, EC 3.2.1.28) from the Saccharomyces cerevisiae helps these organisms to survive adverse living conditions. Nth1 hydrolyses a storage and protective disaccharide trehalose into two molecules of glucose. The activity of this enzyme is regulated by PKA phosphorylation, Ca2+ binding and the yeast 14-3-3 protein (Bmh1) binding. Ca2+ binds to the Ca-binding domain located within N-terminus of Nth1 and contains so called EF-hand motif (D114 TDKNYQITIED125 ) which is highly conserved among many Ca-binding proteins. The main aim of this project was to reveal the structural basis of the Bmh1- and calcium-dependent activation of Nth1. Other goals were to solve the structure of Nth1 itself and the structure of its complex with Bmh1. To reveal how the calcium regulates the Nth1 activity we prepared twelve mutant forms of Nth1 using site directed mutagenesis. These mutations were located within the region of EF-hand motif and its close vicinity. We estimated the enzymatic activity of all these mutants in the presence of Bmh1 and/or Ca2+ . The ability of Nth1 to form stable complexes with Bmh1 was verified using the native polyacrylamide gel electrophoresis and analytical ultracentrifugation. The impact of mutations on the structure and properties of Nth1 was tested using...