Enzymatic synthesis of RNA containing selected base modifications and their influence on stability, translation and CRISPR-Cas9 cleavage

Abstract

Tato práce si klade za cíl úspěšně syntetizovat modifikované nukleosidtrifosfáty (NTP), včetně dříve publikovaných methylsubstituovaných derivátů a nově vyvinutých analogů nesoucích ethylové skupiny v poloze 5 pyrimidinů a poloze 7 deazapurinů. Syntetická cesta zahrnuje Sonogashirovy cross-coupling reakce, následované katalytickou hydrogenací za vzniku odpovídajících nukleosidů, které jsou poté podrobeny fosforylační reakci s POCl3 a pyrofosfátem za účelem získání modifikovaných NTP. V předchozí práci naší skupiny byla prokázána schopnost T7 RNA polymerázy začleňovat malé modifikace do krátké RNA. V této studii byly modifikované nukleotidy začleněny nejen do krátkých RNA, ale také do delších transkriptů, jako jsou sgRNA a mRNA, prostřednictvím in vitro transkripce. V této práci je také použita nově vyvinutá metoda syntézy RNA s využitím DNA polymerázy. Účinnost cappingu Cap1 je vyhodnocena na modifikovaných 70-nukleotidových RNA pro další syntézu mRNA s použitím stejného systému. Účinnost štěpení CRISPR-Cas9 a stabilita v lidském séru byly hodnoceny s různými modifikovanými sgRNA, kde nám molekulární dynamika pomáhá pochopit, proč dva modifikované transkripty ruší aktivitu nukleázy Cas9. Dále byly syntetizovány modifikované mRNA kódující luciferázu Renilla a hodnocena jejich účinnost translace in...