Modulation of the heat shock protein 90 (HSP90) by reversible acetylation

Abstract

HSP90α is an ATP-dependent chaperone whose activity, among other things, is modulated by lysine acetylation, but the functional impact of individual acetylation sites remains unclear. This thesis examines how acetylation of lysines across the N-, middle-, and C-terminal domains of HSP90α affects its stability, oligomeric state, and ATPase activity. Variants with specific acetylated lysine sites were generated by genetic code expansion (orthogonal expression) in HEK293T cells and validated by sequencing, SDS-PAGE, mass spectrometry, and mass photometry. Mass photometry confirmed dimeric assembly for all constructs. Furthermore, the analysis of HSP90α thermal stability revealed that lysine acetylation present at several N-terminal sites, particularly K100 and K112, markedly destabilizes the protein and alters nucleotide-dependent unfolding profiles. ATPase activity of HSP90α was assessed using a luciferase assay that enables estimation of the ADP level present in protein samples. Positive controls (Hsp70, CK1ε) were involved in the study for confirming assay performance. In contrast, Hsp90α preparations from mammalian cells consistently displayed high ATP turnover caused mainly by other ATPases copurified together with HSP90α during Strep-Tactin affinity chromatography. Inclusion of specific...

Hsp90α je ATP-dependentní chaperon, jehož aktivita je mimo jiné regulována pomocí acetylace lysinů, avšak funkční význam jednotlivých acetylovaných míst stále není plně objasněn. Tato diplomová práce zkoumá, jak specificky acetylované varianty Hsp90α v N-terminální, střední a C-terminální doméně ovlivňují stabilitu, oligomerní stav a ATPázovou aktivitu proteinu. Varianty byly exprimovány pomocí rozšíření genetického kódu (ortogonální expresní systém umožňující inkorporaci acetyllysinu) v buňkách HEK293T a ověřeny sekvenováním, SDS-PAGE, hmotnostní spektrometrií a hmotnostní fotometrií. Měření tepelné stability protein pomocí nanoDSF ukázalo, že některé acetylace lysinu v N-terminální doméněe, zejména K100 a K112, výrazně destabilizuje protein a mění profily rozbalení v závislosti na nukleotidech. Hmotnostní fotometrie potvrdila dimerní povahu všech konstruktů, což odpovídá fyziologickému stavu HSP90 v bunce.. ATPázová aktivita byla hodnocena pomocí kvantitativních luminiscenčních testů založených na měření množství ADP ve vzorku. Použití pPozitivních kontrol (Hsp70, CK1ε) potvrdilo správnou funkci testu. U preparátů Hsp90α purifijovaného z lidské buněčné linie se ukázalo, že detekovaná ATPázová aktivita pochází převážně z ATPáz ko-purifikovaných při Strep- Tactinové afinitní chromatografii, nikoli...