Development and evaluation of a new molecular tool for Entamoeba histolytica.

Abstract

Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebiasis, remains challenging to manipulate genetically, and existing tools rarely permit coordinated expression of two genes. This thesis introduces DualP, a modular episomal plasmid that employs a native bidirectional promoter from the highly expressed EHI_127020-EHI_127030 locus to drive simultaneous expression of two open reading frames in E. histolytica. The promoter-two-gene cassette was cloned into a neomycin-resistant backbone, C-terminally tagged with V5, myc, and 6xhis epitopes, and equipped with unique KpnI and BamHI restriction sites to facilitate the exchange of one of the genes of interest. DualP variants encoding peroxisomal proteins PEX11 and PEX14, or the tetracycline repressor TetR with various pre-ATG triplets, were assembled by Gibson cloning, transfected into the pathogenic B2-5 strain, and analyzed by Western blotting and confocal immunofluorescence microscopy. The native DualP construct enabled robust expression of both flanking genes, and replacement of the second gene did not disrupt expression in the opposite direction, confirming the promoter's bidirectional function. Among TetR variants, only the AGA pre-ATG triplet produced a stable line, demonstrating strong context dependence of translation initiation. A TetR-TetO...

Entamoeba histolytica, původce amebiázy, zůstává i přes dostupnost základních genetických nástrojů obtížně geneticky manipulovatelným modelem a stávající systémy jen zřídka umožňují koordinovanou expresi dvou genů. Tato diplomová práce představuje DualP, modulární episomální plazmid využívající přirozený bidirekční promotor z vysoce exprimovaného lokusu EHI_127020-EHI_127030 k řízení současné exprese dvou otevřených čtecích rámců v E. histolytica. Promotorem řízená dvougenová kazeta byla naklonována do plazmidu s neomycinovou rezistencí, oba geny byly na C-konci opatřeny epitopovými značkami V5, myc a 6×His a za účelem usnadnění výměny jednoho z genů zájmu byla doplněna o unikátní restrikční místa KpnI a BamHI. Varianty DualP kódující peroxisomální proteiny PEX11 a PEX14 nebo represor tetracyklinu TetR s různými pre-ATG triplety byly připraveny Gibsonovou metodou, transfekovány do patogenního kmene B2-5 a analyzovány pomocí westernového přenosu a konfokální imunofluorescenční mikroskopie. Výchozí konstrukce DualP umožnila robustní expresi obou ohraničujících genů a náhrada druhého genu nenarušila expresi v opačném směru, což potvrzuje funkční bidirekcionální povahu použitého promotru. Z testovaných TetR variant vedla ke stabilní linii pouze varianta s pre- ATG tripletem AGA, což dokládá silnou...