Molecular and cellular basis of TRPC5 channel regulation

Abstract

Transientní receptorový potenciálový kanonický kanál 5 (TRPC5) je neselektivní kationtový kanál exprimovaný především v centrální a periferní nervové soustavě, kde se podílí na pře- nosu smyslových vjemů a je zapojen v mechanizmech neurovývojových poruch. TRPC5 představuje slibný molekulární cíl farmakologické léčby u stále rostoucího počtu onemoc- nění. Cílem této disertační práce je objasnit několik mechanismů regulace TRPC5: (1) regu- laci prozánětlivým lipidem lysofosfatidylcholinem (LPC 18:1), (2) napěťově řízené oteví- rání iontového kanálu, (3) regulaci analgetikem duloxetinem, (4) vliv mutace R175C spojené s mentálním postižením na funkci a strukturu TRPC5 a (5) vliv značení C-konce fluorescen- čními proteiny na funkční vlastnosti TRPC5. K prozkoumání těchto mechanismů byly pou- žity elektrofyziologické metody, cílená mutageneze a molekulárně-dynamické simulace. Výsledky prezentované v této práci ukazují, že mechanizmus LPC 18:1 regulace TRPC5 kanálu spočívá v zesílení jeho napěťově-závislé aktivace. Do tohoto mechanizmu jsou zapojena rezidua v pórové doméně. Výsledky dále ukazují, že lipid interagující v horní části pórové oblasti tuto oblast stabilizuje. Vzájemné působení lipidu v pórové oblasti s de- polarizačním napětím vyvolává otevření kanálu. Výsledky také ukazují, že duloxetin inhi-...

Transient Receptor Potential Canonical 5 (TRPC5) is a non-selective cation channel mainly expressed in the central and peripheral nervous systems, where it is involved in sensory transduction and in various neurodevelopmental disorders. TRPC5 is emerging as a promis- ing pharmacological target in a growing number of diseases. This doctoral thesis aims to elucidate multiple mechanisms of TRPC5 regulation: (1) the regulation by the pro-inflam- matory lipid lysophosphatidylcholine (LPC 18:1), (2) the voltage-induced gating, (3) the regulation by the analgesic drug duloxetine, (4) the functional and structural consequences of the TRPC5 mutation R175C associated with intellectual disability, and (5) the influence of C-terminal tagging with fluorescent proteins on the functional properties of TRPC5. To investigate these mechanisms, a combination of electrophysiology, site-directed mutagene- sis, and molecular dynamics simulations was employed. The results presented in the thesis demonstrate that LPC 18:1 regulates TRPC5 by potentiating the voltage-dependent mode of its activation, and this regulation involves con- served residues of the pore domain. Further, it is shown that a lipid interacting in the upper pore region stabilizes this area, and this lipid-pore interaction acts together with depolarizing...