Molecular mechanisms of cholesterol and steroid effects on the function of muscarinic and opioid receptors

Abstract

Steroidní hormony a cholesterol jsou stále častěji rozpoznávány jako modulátory GPCR receptorů třídy A, avšak přesná místa a mechanismy jejich působení zůstávají nejasné. Tato disertační práce testovala hypotézu, že steroidy a cholesterol působí prostřednictvím společného, nekanonického alosterického místa na muskarinových a opioidních receptorech, a hodnotila fyziologický význam této modulace. Pomocí vazebných pokusů s radioligandy a měření funkčních odpovědí následně vyhodnocených operačním modelem alostericky modulovaného agonismu jsme ukázali, že endogenní steroidy v koncentracích odpovídajících fyziologickým, či blízce fyziologickým hodnotám, alostericky modulují odpovědi muskarinových receptorů na acetylcholin. Na základě molekulárního modelování jsme identifikovali společné "nekanonické" alosterické vazebné místo pro cholesterol a steroidy v rýze mezi TM6 a TM7 šroubovicemi, kde klíčovou roli hraje zbytek Arg6.35 . Substituce této aminokyseliny za alanin či glutamin, reprodukovaly funkční fenotyp deplece membránového cholesterolu, čímž byla potvrzena její zásadní úloha. Dále jsme pozorovali, že deplece cholesterolu měla diferencované účinky na jednotlivé receptorové rodiny: signalizace muskarinových receptorů M2/M4 byla zesílena, zatímco signalizace δ-, κ- a μ-opioidních receptorů byla...

Steroid hormones and cholesterol have become recognised as modulators of class A GPCRs. However, the exact sites and mechanisms of their action remain unclear. This thesis tested the hypothesis that steroids and cholesterol act through a common non-canonical allosteric site on muscarinic and opioid receptors, and assessed the physiological significance of this modulation. Using radioligand binding and functional assays in line with the operational model of allosterism, we demonstrate that, at physiological to near-physiological concentrations, endogenous steroids allosterically modulate muscarinic receptor responses to acetylcholine. Guided by molecular modelling, we identified a shared 'non-canonical' allosteric site for cholesterol and steroids in the intracellular groove between TM6 and TM7, with Arg6.35 acting as a key anchor. Critically, substitutions of Arg6.35 with alanine or glutamine reproduced the functional phenotype of membrane cholesterol depletion, thus confirming the importance of this residue. We also observed that cholesterol depletion affected different receptor families in different ways: muscarinic M2/M4 signalling was enhanced, whereas δ-, κ-, and μ-opioid receptor signalling was attenuated. This indicates that these GPCR families are stabilised in different ways by...