Structural and biophysical characterisation of Siglec-7, an inhibitory NK cell receptor: insights into stability, dimerisation, and ligand binding

Abstract

Natural killer (NK) cells are innate immune effectors capable of rapidly mediating cellular cytotoxicity against pathogen-infected, stressed, or malignantly transformed cells while also modulating immune responses through the secretion of chemokines and cytokines. Their activity is regulated by a repertoire of activating and inhibitory receptors capable of recognising cognate ligands on virtually every cell. Siglec-7, an inhibitory receptor mainly expressed by NK cells, has emerged as a promising immune checkpoint target in cancer immunotherapy. While its role in immunoediting and immune evasion is established, significant gaps remain in our understanding of its biological context, the structural basis of ligand binding, and molecular mechanisms governing its signalling. This study presents key insights into the recombinant production, stability, dimerisation, and isotopic labelling of Siglec-7, with a focus on their suitability for structural and functional studies. Our findings reveal that the commonly used Siglec-7_hIgG_Fc fusion construct displays impaired stability and should be used with a thorough understanding of its limitations. Importantly, we report the novel observation of noncovalent dimerisation of the extracellular domain of Siglec-7 even at low micromolar concentrations - a finding...

Přirozeně zabíječské buňky (NK buňky, z angl. natural killer cells) jsou vrozené imunitní efektory schopné rychle zprostředkovat buněčnou cytotoxicitu proti buňkám infikovaným patogeny, vystaveným stresu nebo maligně transformovaným a zároveň modulovat imunitní reakce prostřednictvím sekrece chemokinů a cytokinů. Jejich aktivita je regulována repertoárem aktivačních a inhibičních receptorů, které jsou schopny rozpoznat příbuzné ligandy prakticky na každé buňce. Siglec-7, inhibiční receptor exprimovaný hlavně NK buňkami, se stal slibným cílem coby imunitní kontrolní bod v imunoterapii rakoviny. Ačkoli je jeho úloha v imunoeditaci a vyhýbání se imunitnímu systému prokázána, v našem chápání jeho biologického kontextu, strukturních základů vazby ligandů a molekulárních mechanismů řídících jeho signalizaci přetrvávají značné mezery. Tato studie představuje klíčové poznatky o rekombinantní produkci, stabilitě, dimerizaci a izotopovém značení Siglec-7 se zaměřením na jejich vhodnost pro strukturní a funkční studie. Naše zjištění ukazují, že běžně používaný fúzní konstrukt Siglec-7_hIgG_Fc vykazuje zhoršenou stabilitu a měl by být používán jen s důkladným pochopením těchto omezení. Důležitým novým poznatkem je pozorování nekovalentní dimerizace extracelulární domény Siglec-7, a to i při nízkých...