Optimization of recombinant protein production in E. coli expression system by genetic engineering methods

Abstract

v češtině V této práci představuji inovativní přístup k optimalizaci sekvencí kódujících N-konec rekombinantních proteinů, díky čemuž je možné zvýšit jejich výtěžnost v expresním systému Escherichia coli. Předchozí studie ukazují, že specifické sekvence bezprostředně následující iniciační kodon, souhrnně označované v této práci jako N-terminální sekvence, mají zásadní vliv na expresi rekombinantních proteinů. Zatímco předchozí výzkumy se zaměřily především na omezený výběr uměle navržených sekvencí, já jsem použil přístup založený na řízené evoluci, který umožňuje prověření rozsáhlých knihoven různorodých N-terminálních sekvencí. Pro zjednodušení identifikace konstruktů s optimalizovanou expresí jsem připojil na C-konce studovaných proteinů GFP, což umožnilo použití buněčné separace založená na principu průtokové cytometrie k izolaci buněk s vyšší úrovní produkce na základě pozorované intenzity fluorescence. Tento systematický postup umožnil dosáhnout až 30násobného zvýšení výtěžků různých rozpustných rekombinantních proteinů. Během tohoto výzkumu jsem navázal na metodiky z předchozího výzkumu umělých malých vazebných proteinů, během kterého se mimo jiné ukázala důležitost N-terminální oblasti pro produkci rekombinantních proteinů. Pro vývoj vazebných proteinů byl aplikován přístup řízené evoluce s...

In this study, I introduce an innovative approach to optimize sequences coding for the N-termini of recombinant proteins to enhance their production yield in Escherichia coli. Previous findings by others have indicated that specific sequences immediately following the initiation codon, collectively referred to here as the N-terminal sequences, have a profound influence on protein expression. While these earlier efforts have mainly relied on a limited selection of rationally designed sequences, I employed a directed evolution-based approach that screens large libraries of diversified N-terminal sequences. To streamline the identification of constructs with optimized expression levels, I fused a GFP marker to the C-terminus of the target proteins and used fluorescence-activated cell sorting to isolate cells showing higher expression levels based on their fluorescence intensity. This systematic workflow enabled me to achieve up to a 30-fold increase in the production yield of soluble recombinant proteins across various constructs. In this research, I built upon methodologies and experience from prior studies on engineering small binding proteins ("scaffolds"), which highlighted the importance of the N-terminal region for recombinant protein production and modified the purpose and construction of DNA...