Enzymová syntéza a studium vlastností DNA nesoucí elektron-donorní nebo elektron-akceptorní skupiny na nukleobázích

Abstract

Modification of nucleic acids represents an important tool in modern bioorganic chemistry, enabling the expansion of their natural properties with new functional characteristics that can be utilized in structural studies. This bachelor's thesis focuses on the synthesis and characterization of modified 2'-deoxyribonucleoside triphosphates bearing benzodioxole electron-donating (DOx) and difluorophenyl electron-accepting (2F) functional groups, and their application in enzymatic DNA synthesis. The modifications were introduced at position 5 of cytosine and at position 7 of 7-deazaadenine via Sonogashira cross-coupling reaction. Both synthesized triphosphates were characterized using NMR and mass spectrometry. For a more comprehensive evaluation of the electronic effects, other two nucleoside triphosphates (dCOMe TP and dAF TP), synthesized in prof. Michal Hock's group, were also included. Recombinant thermostable DNA polymerase KOD(exo−) was expressed in E. coli BL21-AI cells and tested along with other DNA polymerases - KOD XL, Vent, Vent(exo−) for their ability to incorporate modified nucleotides using primer extension (PEX) method. Enzymatic synthesis by DNA polymerase chain reaction (PCR) was tested with three DNA polymerases - KOD(exo−), KOD XL, and Vent(exo−). The results from PEX experiments...

Modifikace nukleových kyselin představují významný nástroj moderní bioorganické chemie umožňující rozšíření jejich přirozených vlastností o nové funkční charakteristiky využitelné ve strukturálních studiích. Tato bakalářská práce se zabývá syntézou a charakterizací modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů obsahující benzodioxolovou elektron-donorní (DOx) nebo difluorfenylovou elektron-akceptorní (2F) modifikaci, a jejich aplikací při enzymové syntéze DNA. Modifikace byly zavedeny do pozice 5 u cytosinu a do pozice 7 u 7-deazaadeninu pomocí Sonogashira cross-coupling reakce. Oba syntetizované trifosfáty byly charakterizovány pomocí NMR a hmotnostní spektrometrie. Pro komplexnější hodnocení vlivu elektronových efektů byly zahrnuty i další nukleosid trifosfáty (dCOMe TP a dAF TP), které byly syntetizovány ve skupině prof. Michala Hocka. Byla exprimována rekombinantní termostabilní DNA polymerasa KOD(exo−) v buňkách E. coli BL21-AI a společně s dalšími DNA polymerasami - KOD XL, Vent, Vent(exo−) a KOD testována na schopnost inkorporovat modifikované nukleotidy metodou prodlužování primeru (PEX). Enzymová syntéza metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) byla testována třemi DNA polymerasami - KOD(exo−), KOD XL a Vent(exo−). Výsledky PEX experimentů ukázaly, že čtyři z pěti testovaných DNA...