Exprese a charakterizace nové fungální chitindeacetylasy

Abstract

Chitin is the second most abundant biopolymer in nature. Its derivatives chitosan and especially chitooligosaccharides exhibit a broad spectrum of biological activities with applications in biomedicine, agriculture, food industry, cosmetics and other fields. Chitooligosaccharides (COS) are characterized by their degree of polymerization, degree of acetylation and pattern of acetylation. Their synthesis is mostly carried out by chemical methods, which bring unwanted negative effects on the environment. Therefore, the biotechnological method of COS synthesis has recently become the focus of research. Biotechnological methods involve the use of specific enzymes, such as chitinases, chitosanases and chitin deacetylases for an efficient, reliable and sustainable synthesis of defined COS. The aim of this study was the expression of a novel fungal chitin deacetylase from Aspergillus flavus (AfCDA) in the Pichia pastoris expression system, its purification by FPLC and the study of its properties and catalytic abilities. Expression and production of the enzyme was successfully carried out at a scale of about 1 g/l of production medium. Its subsequent purification by FPLC failed to yield an enzyme isolate, and therefore, a concentrate of unpurified medium was used in reactions instead. The results of LC-MS...

Chitin je druhým nejrozšířenejším biopolymerem v přírodě. Jeho deriváty chitosan a zejména chitooligosacharidy vykazují široké spektrum biologických aktivit a jsou využitelné v biomedicíně, zemědělství, potravinářství, kosmetice a dalších oborech. Chitooligosacharidy (COS) jsou charakterizovány stupněm polymerace, stupněm acetylace a vzorem acetylace. Jejich syntéza je prováděna nejčastěji chemickými metodami, které mají ale nežádoucí negativní vliv na životní prostředí. Proto se v poslední době stala biotechnologická cesta jejich syntézy cílem mnoha výzkumů. Biotechnologické metody využívají enzymy jako chitinasy, chitosanasy a chitindeacetylasy pro efektivní, spolehlivou a ekologicky udržitelnou syntézu definovaných COS. Bohužel v současnosti stále nejsou k dispozici metody pro robustní biosyntézu definovaných chitooligosacharidů v průmyslovém měřítku. Cílem této práce byla exprese nové fungální chitin deacetylasy z Aspergillus flavus (AfCDA) v expresním systému Pichia pastoris, její purifikace pomocí FPLC a studium jejích vlastností a katalytických schopností. Exprese a produkce enzymu byla úspěšně provedena v měřítku přibližně 1 g/l produkčního média. Purifikací produkčních médií pomocí FPLC se nepodařilo získat enzymový izolát, a proto bylo v reakčních směsích používáno koncentrované...