Příprava mutovaných forem proteinu CD69, receptoru lidských lymfocytů

Abstract

The CD69 receptor, known as an early lymphocyte activation marker, is a surface protein expressed on activated leukocytes where it plays an important role in regulating the immune response. This receptor forms a disulfide-linked homodimer and its extracellular domain contains two N-linked glycosylation sites that may influence its interactions with ligands. Three stably transfected HEK293T cell lines expressing mutant forms of the extracellular part of the CD69 protein were prepared as part of this thesis. These variants were created by point mutation in the region of the N-glycosylation sites. Transfection was performed using the piggyBac transposon system. The expressed proteins were subsequently purified by immobilised-metal affinity chromatography and size-exclusion chromatography. The purity and oligomeric state of the proteins were verified by gel electrophoresis under reducing and non- reducing conditions. The aim of this work was to create variants of the CD69 protein with targeted point mutations of the glycosylation sites to allow subsequent tests of its interaction with Galectin-1. Proteins prepared in this way provide a basis for understanding the influence of individual glycan motifs on the binding of this immunomodulatory ligand.

Receptor CD69, známý jako časný aktivační marker lymfocytů, je povrchový protein exprimovaný na aktivovaných leukocytech, kde hraje důležitou roli v regulaci imunitní odpovědi. Tento receptor tvoří disulfidicky vázaný homodimer a jeho extracelulární doména obsahuje dvě místa pro N-vázanou glykosylaci, která mohou ovlivňovat jeho interakce s ligandy. V rámci této bakalářské práce byly připraveny tři stabilně transfekované buněčné linie HEK293T, v nichž byly exprimovány mutantní formy extracelulární části proteinu CD69. Tyto varianty byly vytvořeny bodovou mutací v oblasti N-glykosylačních míst. Transfekce byla provedena pomocí transposonového systému piggyBac. Exprimované proteiny byly následně purifikovány pomocí chelatační afinitní chromatografie a gelové permeační chromatografie. Čistota a oligomerní stav proteinů byly ověřeny pomocí gelové elektroforézy v redukujících i neredukujících podmínkách. Cílem této práce bylo vytvořit varianty proteinu CD69 s cílenou bodovou mutací glykosylačních míst, která umožní následné testování jeho interakce s Galektinem-1. Takto připravené proteiny představují základ pro pochopení vlivu jednotlivých glykanových motivů na vazbu tohoto imunomodulačního ligandu.