Missense Mutations of Hexokinase Isoenzymes: Stability and Activity in Response to pH and Temperature Changes

Abstract

Hexokináza je zásadní enzym, který je široce studován v biochemii a biologii. Usnadňuje počáteční krok glykolýzy, kde působí jako jeden z regulačních bodů tohoto klíčového metabolického procesu. Glykolýza hraje nezbytnou roli v energetickém metabolizmu buňky a udržování její funkce. Její deregulace je spojena s řadou onemocnění. Vysoce proliferující nebo nádorové buňky vykazují zvýšenou závislost na metabolismu glukózy. Nádorové buňky, které podléhají metabolickému přepogramování, často vykazují zvýšenou expresi specifických izoforem hexokinasy, přičemž v některých případech byly zaznamenány i mutace v příslušných genech. Tato diplomová práce přináší komplexní analýzu hexokinasy I a hexokinasy II, se zaměřením na dopad 15 opakujících se mutací identifikovaných u různých typů rakoviny. Tyto varianty byly zavedeny do rekombinantních proteinových konstruktů, exprimovány a purifikovány. Byla provedena enzymatická analýza, která hodnotila kinetické chování těchto mutací za různých experimentálních podmínek, s cílem zjistit, zda tyto změny poskytují enzymu funkční výhodu. Výzkum se primárně zaměřil na hodnocení stability a katalytické účinnosti těchto variant hexokinasy při různých fyziologicky relevantních hodnotách pH a teplotách. Výsledky ukazují, že většina mutací neměla významný vliv na katalytickou...

Hexokinase is a fundamental enzyme widely studied in biochemistry and biology. It facilitates the initial step of glycolysis, acting as a rate-limiting checkpoint of the essential metabolic pathway. Glycolysis plays a vital role in the energetic balance of the cell and the maintenance of cellular function. Its dysregulation is implicated in numerous diseases. Highly proliferative or neoplastic cells demonstrate an augmented dependence on glucose metabolism. Cancer cells, metabolically reprogrammed, display even elevated expressions of a specific hexokinase isoform, and in some instances, mutations have been spotted within the corresponding genes. This thesis comprehensively analyzes Hexokinase I and Hexokinase II, focusing on the impact of 15 recurrent mutations identified across various cancers. These variants were introduced into a recombinant protein construct, expressed, and purified. An enzymatic assay was performed to analyze their kinetic behavior under diverse experimental conditions to assess whether these alterations provide any functional advantage to the enzyme. The research primarily evaluates these hexokinase variants' stability and Vmax across various physiologically relevant pH and temperatures. The findings reveal that while most mutations did not significantly alter catalytic...