Role of nucleolar phosphoproteins in response of leukemic cells to nucleolar stress

Abstract

V podmínkách buněčného stresu vyvolaného např. chemickými látkami poškozujícími DNA, hypoxií nebo UV ozářením dochází k narušení struktury buněčného jadérka a jeho funkce. Stres způsobující takové narušení integrity jadérka se označuje jako nukleolární. Projevuje se delokalizací proteinů jadérka, zejména fosfoproteinů nukleofosminu (NPM) a nukleolinu (NCL), do nukleoplazmy, potažmo cytoplazmy. Tato práce se zabývá reakcí zmíněných nukleolárních proteinů na jednu složku nukleolárního stresu, oxidativní stres, a je inspirována publikací vyšetřující roli jednoho z cysteinů v molekule NPM, Cys275 (Yang et al.2016). V první části je popsána konstrukce plazmidů pro expresi fluorescenčně značených mutovaných variant NPM a NCL, které se od přirozené formy liší zastoupením cysteinů, a mohly by proto mít změněnou odpověď na oxidativní stres. Pomocí konfokálního mikroskopu jsme sledovali chování těchto proteinů v buňkách linie HeLa opůsobených různými stresory. Z testovaných stresorů jsme pro bližší zkoumání zvolili doxorubicin, který je hojně používán pro léčbu nádorových onemocnění, včetně leukémie, a jedním ze známých mechanismů jeho účinku je právě vyvolávání oxidativního stresu. Druhá část práce se věnuje analýze vlivu doxorubicinu na morfologii a viabilitu buněk, zaznamenává typické znaky apoptózy a...

Under cellular stress conditions induced e.g. by chemicals detrimental to DNA, hypoxia or UV irradiation, the nucleolar structure and function is compromised. Stress leading to such damage to the integrity of nucleolus is called nucleolar. It manifests by delocalization of nucleolar protein, namely the phosphoproteins nucleophosmin (NPM) and nucleolin (NCL), to the nucleoplasm or even cytoplasm. This thesis focuses on the aforementioned nucleolar proteins, and a subtype of nucleolar stress - oxidative (redox) stress, and is inspired by a publication examining the role of the cysteines (Cys275) in NPM (Yang et al. 2016). The first section describes the construction of plasmids for the expression of fluorescently labeled mutated variants of NPM and NCL, which deviate from the wild type in the number of cysteines present and as such may have an altered response to redox stress. Under a confocal microscope, we observed the behavior of these proteins in HeLa cells treated by different types of stressors. We eventually chose doxorubicin from these stressors, which is a chemotherapeutic drug widely used to treat cancers, including leukemia, and one of mechanisms of action is inducing redox stress. The second part of the thesis analyses the influence of doxorubicin on the morphology and viability of cells,...