Functional analysis of selected variants of uncertain significance in cancer predisposing genes

Abstract

Inherited mutations in predisposing genes significantly contribute to the development of various cancers. Current genetic testing via panel sequencing efficiently identifies pathogenic germline mutations in the TP53 gene, which can cause hereditary Li-Fraumeni syndrome (LFS) associated with greatly increased risk of tumor development. However, variants of uncertain significance (VUS) can complicate clinical interpretation. This thesis aims to evaluate the functional significance of selected variants in the TP53 gene, identified by genetic screening particularly in the Czech population. TP53 is crucial for cell cycle regulation, induction of apoptosis, DNA repair and other functions and its dysregulation is associated with cancer. Using CRISPR/Cas9 technology, we generated a cellular model with inactivated TP53 gene. Further work included preparing expression plasmids carrying coding sequences for fluorescent markers, cDNA of selected TP53 variants, and selection cassettes. The function of the mutated versus the wild-type gene forms was compared after transfection and generation of stable cell lines. Eventually, the expression of CDKN1A and MDM2 genes among the cell lines after nutlin-3a treatment was assessed. Additionally, the role of selected TP53 variants in the p53 tetramer formation and colony...

Dědičné mutace v predispozičních genech významně přispívají ke vzniku různých druhů rakoviny. Současné genetické testování pomocí panelového sekvenování účinně identifikuje patogenní zárodečné mutace v genu TP53, které mohou způsobit Li-Fraumeni syndrom (LFS) spojený s výrazně vyšším rizikem vzniku nádoru. Varianty nejasného významu (VUS) mohou však klinickou interpretaci komplikovat. Cílem této práce je zhodnotit funkční význam vybraných variant genu TP53 identifikovaných genetickým screeningem zejména české populace. Gen TP53 je klíčový pro regulaci buněčného cyklu, indukci apoptózy, opravu DNA a další funkce a jeho dysregulace je spojována s nádorovými onemocněními. Pomocí technologie CRISPR/Cas9 jsme vytvořili buněčný model s inaktivovaným genem TP53. Další práce zahrnovala přípravu expresních plazmidů nesoucích kódující sekvence pro fluorescenční markery, cDNA vybraných TP53 variant a selekční kazety. Po transfekci a vytvoření stabilních buněčných linií byla porovnána funkce mutovaných a wild-type forem genů. Nakonec byla napříč buněčnými liniemi vyhodnocena exprese genů CDKN1A a MDM2 po použití nutlinu-3a. Kromě toho byla analyzována role vybraných variant TP53 při tvorbě p53 tetrameru a testu tvorby kolonií. Tato práce přispívá k hlubšímu pochopení buněčných funkcí některých mutací TP53....