Vliv inhibitorů topoizomeráz na aktivaci DNA senzoru cGAS

Abstract

Součástí vrozeného imunitního systému je multifunkční protein cGAS (cyklická GMP-AMP syntáza), který je znám především svou rolí cytosolického DNA senzoru. Detekuje patogenní, ale také buňce vlastní DNA, která byla z jádra či mitochondrií uvolněna do cytosolu v důsledku poškození. Prostřednictvím adaptorového proteinu STING (stimulátor interferonových genů) poté dochází k indukci interferonové odpovědi a produkci prozánětlivých cytokinů. Tato diplomová práce se zaměřuje na aktivaci dráhy cGAS-STING v důsledku poškození způsobeném inhibitory topoizomeráz - kamptotecinem a etoposidem. Inhibitory topoizomeráz jsou často využívané jako chemoterapeutika a spojitost jejich působení s indukcí cytokinové odpovědi prostřednictvím dráhy cGAS-STING je podstatou nově vznikajícího konceptu chemoimunoterapie. Stanovením cytotoxicity, detekcí mikrojader a proteinu γH2AX byly nejprve standardizovány koncentrace inhibitorů. Výsledky ukazují, že po ošetření myších embryonálních fibroblastů (MEF) etoposidem došlo ke zvýšené produkci IFNβ, ISG15 a IL-6. V případě kamptotecinu byla produkce těchto molekul značně snížena. Aktivace dráhy cGAS-STING byla ověřena stanovením koncentrace cGAMP a detekcí fosforylovaného proteinu STING. Získaná data naznačují, že za indukci vrozené imunitní odpovědi po ošetření buněk MEF...

A component of the innate immune system is the multifunctional protein cGAS (cyclic GMP-AMP synthase), which is primarily known for its role as a cytosolic DNA sensor. It detects pathogenic as well as self DNA that has been released into the cytosol from the nucleus or mitochondria due to damage. This leads to the induction of interferon responses and production of pro-inflammatory cytokines via the adaptor protein STING (stimulator of interferon genes). This thesis focuses on the activation of the cGAS-STING pathway due to damage caused by topoisomerase inhibitors - camptothecin and etoposide. Topoisomerase inhibitors are often used as chemotherapeutic agents, and their association with the induction of cytokine responses via the cGAS-STING pathway forms the basis of the emerging concept of chemoimmunotherapy. The concentrations of the inhibitors were first standardized by determining cytotoxicity, detection of micronuclei and the protein γH2AX. The results show that treatment of mouse embryonic fibroblasts (MEF) with etoposide led to increased production of IFNβ, ISG15, and IL-6. In the case of camptothecin, the production of these molecules was significantly reduced. Activation of the cGAS-STING pathway was verified by determining the concentration of cGAMP and detecting the phosphorylated STING...