Tracking membrane permeabilization on single lipid vesicles - method development.

Abstract

Protein complexes are challenging systems to study, especially when these complexes form on lipid membranes only for a short period of time. This is also the case of fibroblast growth factor 2 (FGF2), a protein that has many physiological and pathological functions in the human organism. It plays major role in the development of cancer as it promotes cell survival and angiogenesis. It also serves as a basis for development of novel treatments of nerve injuries. Despite being heavily studied for many years, it remains unclear how the protein is translocated into the extracellular space where it performs its function. To study complex systems such as FGF2 that self-assembles on the membrane into membrane penetrating pores we decided to develop a simple and efficient fluorescent microscopy method. This method is called double leakage single GUV assay (DLSGA). It utilizes giant unilamellar vesicles (GUVs) mimicking native cellular membranes. In a single experiment, up to 300 individual GUVs are imaged for the content of a leakage dye that reports on the presence of FGF2 pores. During three measurements and under different conditions, detailed information about pore-opening dynamics is gained for each GUV. Results of these measurements are then used to divide GUVs into six groups based on formation and...

Proteinové komplexy se obtížně studují, obzvlášť pokud vznikají jen v membránovém prostředí a na velmi krátkou dobu. Toto je problematické například v případě fibroblastového růstového faktoru 2 (FGF2), což je protein s mnoha fyziologickými i patologickými funkcemi v lidském organismu. Hraje zásadní roli v rozvoji různých nádorových onemocnění, protože braní apoptóze buněk pomocí autokrinní signalizace a také stimuluje angiogenezi. Zároveň je v současné době zkoumána možnost jeho uplatnění v léčbě zranění periferního nervstva. Přestože je důkladně zkoumán již řadu let, mechanismus jeho translokace do mezibuněčného prostoru, kde vykonává svou funkci, nebyl zcela objasněn. Pro studium komplexních systému, jako jsou membránové póry tvořené FGF2, jsme vyvinuli jednoduchou a efektivní metodu fluorescenční mikroskopie. Tato metoda se jmenuje dvojitá permeabilizační esej jednotlivých vezikulů (DLSGA). Využívá lipidové vezikuly (GUVs) pro simulaci buněčné membrány. V jediném experimentu je možné sledovat až 300 jednotlivých vezikulů a tvorbu pórů v jejich membráně. Během třech měření za různých podmínek získáváme detailní informaci o dynamice otevírání pórů na každém vezikulu. Na základě těchto měření je možné jednotlivé vezikuly rozdělit do šesti skupin podle toho, jestli se na nich tvořili póry a jak...