Úloha Bmh proteinů v regulaci kvasničného enzymu neutrální trehalasy Nth1.

Abstract

Neutral trehalase 1 (nth1) is a yeast enzyme from the family of hydrolases, which catalyzes hydrolysis of trehalose to two glucose molecules. Trehalose is a non-reducing disacharide, which serves as a carbon source in a yeast cells as well as a stress metabolite. When a cell is under stress conditions it accumulate trehalose and through the recovery process the trehalose is hydrolyses by trehalases. The main subject of our study was Nth1 from S. cerevisiae. It was published earlier (Panni, S., et al., 2008), that Nth1 must be phosphorylated by PKA and in the presence of 14-3-3 protein to be active. The activity of Nth1 also slightly increases in the presence of Ca2+ ions (Franco, A., et al., 2003). 14-3-3 proteins are family of acid regulatory proteins, which participates in variety of processes in the cells, like regulation of the cell- cycle, cell metabolism, transcription, apoptosis etc. They have more than 400 known binding partners. There are many isoforms of 14-3-3 proteins through all eukaryotic organisms; there are two isoforms in yeast, called Bmh1 and Bmh2 (Obsil, T., Obsilova, V., 2011). To investigate details of activation of Nth1 by Bmh the whole spectrum of biochemical and biophysical methods was used. By site-directed mutagenesis, sedimentation analysis and enzyme activity assay was...

Neutrální trehalasa 1 (Nth1) je kvasničný enzym z rodiny hydrolas, který katalyzuje štěpení trehalosy na dvě molekuly glukosy. Trehalosa je neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zdroj uhlíku a také jako stresový metabolit. Buňka v teplotním či chemickém stresu nahromadí trehalosu, které je v rámci zotavení se po ukončení stresových podmínek hydrolyzována trehalasou. Předmětem našeho výzkumu byla Nth1 ze S. cerevisiae. Jak bylo publikováno dříve (Panni, S., et al., 2008), Nth1 musí být fosforylována PKA a v přítomnosti kvasničné isoformy proteinu 14-3-3, aby byla aktivní. Aktivita také v menší míře vzroste v přítomnosti iontů Ca2+ (Franco, A., et al., 2003). Proteiny 14-3-3 jsou kyselé regulační proteiny, které se vyskytují ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů, jako je regulace buněčného cyklu, buněčný metabolismus, tranksripce, apoptosa a další. Proteiny 14-3-3 mají přes 400 známých vazebných partnerů a vyskytují se v mnoha isoformách v různých organismech. V kvasinkách se nalézají dvě isoformy, Bmh1 a Bmh2 (Obsil, T., Obsilova, V., 2011). Na detailní zkoumání aktivace Nth1 pomocí Bmh1 a Bmh2 bylo použito spektrum biochemických i biofyzikálních metod. Pomocí bodové mutagenese, měření sedimentační rychlosti na analytické ultracentrifuze a...