Development and characterization of light-producing deoxyribozymes

Abstract

Light-producing protein enzymes such as luciferase play important roles in both applied and basic research. In this study, we used an in vitro selection to isolate deoxyribozymes that catalyze a chemiluminescent reaction by dephosphorylation of the commercial substrate CDP-Star. One of the most active variants, named Supernova, was further improved and characterized using a combination of random mutagenesis, in vitro reselection, high-throughput sequencing, comparative sequence analysis, and optimization of reaction conditions. Supernova produces light up to 6,500-fold more efficiently that the background reaction and folds into an unusual triple-helical structure. Moreover, we characterized in detail the buffer requirements including pH, the effect of various ions, substrate and Supernova concentrations, and the presence of crowding agents. Finally, we showed that Supernova can be turned into an allosteric sensor by rational design. We anticipate that this deoxyribozyme can be used as the signaling component in light-producing allosteric deoxyribozyme sensors that respond to a wide variety of stimuli and will complement existing methods that utilize radioactive, fluorescent, and colorimetric readouts.

Chemiluminiscenční proteinové enzymy jako je například luciferáza mají mnoho využití jak v aplikovaném tak i základním výzkumu. V této práci jsme využili metody in vitro selekce, abychom identifikovali deoxyribozymy, které katalyzují chemiluminiscenční reakci. Tyto DNA enzymy světlo produkují pomocí defosforylace komerčně dostupného substrátu CDP-Star. Jednu z nejaktivnějších variant, kterou jsme pojmenovali Supernova, jsme dále vylepšili a popsali pomocí kombinace náhodné mutageneze, in vitro reselekce, sekvenování nové generace, komparativní sekvenové analýzy a optimalizace reakčních podmínek. V současnosti Supernova produkuje světlo 6.500-krát účinněji než reakce CDP-Star bez přidaného enzymu a zaujímá nezvyklou strukturu obsahující trojšroubovici DNA. V rámci charakterizace reakčních podmínek Supernovy jsme dále popsali její nároky na pH, koncentraci Supernovy i substrátu a přítomnost iontů či zahušťovacích činidel. V neposlední řadě jsme ukázali, že Supernova může být pomocí racionálního designu přeměněna na alosterický senzor. Předpokládáme, že námi vyvinutý deoxyribozym bude využíván jako signální část v alostericky regulovaných senzorech, které detekují rozmanité ligandy, a doplní tak ostatní metody využívající radioaktivitu, fluorescenci, či změnu barvy.