Functional analysis of the TSSC4 chaperone during snRNP formation

Abstract

Splicing is a process, during which non-coding sequences (introns) are cleaved out of pre-mRNA, and exons are ligated. This whole process is catalysed by a multi-megadalton splicing complex, composed of five small nuclear ribonucleoprotein particles (shortly snRNPs), which each contains its own small nuclear RNA molecule and specific set of proteins. During the biogenesis of snRNPs, U4 and U6 snRNPs are assembled to form the di-snRNP, which further associates with U5 snRNP and gives rise to tri-snRNP. With the help of mass spectrometry, we have found previously uncharacterized protein interacting with U5 snRNP, called TSSC4. By immunoprecipitation, I confirmed TSSC4 as a U5 snRNP specific protein and identified the region of TSSC4 responsible for interaction with U5 snRNP. I also showed that TSSC4 interacts with PRPF19, a component of complex driving the catalytic activation of the spliceosome and that this interaction is U5 snRNP-independent. Knockdown of TSSC4 in HeLa cells results in accumulation of di-snRNAs and U5 snRNP in Cajal bodies, nuclear compartments involved in snRNP biogenesis. Similar phenotype was previously observed upon inhibition of tri-snRNP assembly. To analyse the importance of TSSC4 for tri-snRNP assembly, I separated individual snRNPs by glycerol gradient ultracentrifugation...

Sestřih je proces, během kterého jsou nekódující sekvence (introny) vystřiženy z pre-mRNA a exony spojeny. Celý tento proces je katalyzován multi-megadaltonovým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (zkráceně snRNP částice), jenž každá obsahuje svoji vlastní malou jadernou RNA a sadu proteinů specifických pro každou částici. Během biogeneze snRNP částic jsou U4 a U6 snRNP částice spojeny za vzniku di-snRNP částice, která je dále asociována s U5 snRNP částicí a tím dává vzniku tri-snRNP. S pomocí hmotnostní spektrometrie jsme nalezly dříve necharakterizovaný protein interagující s U5 snRNP částicí, zvaný TSSC4. S použitím imunoprecipitace jsem potvrdila specificitu TSSC4 pro U5 snRNP a nalezla oblast TSSC4 zodpovědnou za interakci s U5 snRNP. Nezávisle na U5 snRNP částici, TSSC4 interaguje s PRPF19, komponentem komplexu, který se účastní katalytické aktivace sestřihového komplexu. Snížení koncentrace TSSC4 v HeLa buňkách způsobuje akumulaci di-snRNP specifických RNA a U5 snRNP částice v Cajalových tělískách, jaderných organelách důležitých pro biogenezi snRNP částic. Podobný fenotyp byl dříve pozorován po zastavení tvorby tri-snRNP částice. Abych otestovala důležitost TSSC4 pro vznik tri-snRNP, pomocí gradientové ultracentrifugace jsem rozdělila...