Advanced fluorescence techniques applied on biomolecules (lipid membranes and DNA)

Abstract

Tato práce popisuje dvě pokročilé fluorescenční metody: metodu zkoumající časový vývoj Stokesova posunu fluorescenčního spektra (TDFS) a fluorescenční korelační spektroskopii (FCS) včetně jejích speciálních obměn - časově rozlišené FCS, Z-scan FCS a dvojohniskové FCS. Metody byly aplikovány ve výzkumu DNA a lipidových membrán. Přispěli jsme k objasnění mechanismu kondenzace molekul DNA menších, než je rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu. Kondenzace polykationem sperminem je zřejmě proces diskrétní ("all or non"), při použití kladně nabitého surfaktantu kondenzace probíhá naopak postupně. Dále jsme zkoumali biofyzikální vlastnosti fosfolipidové membrány ovlivněné přítomností oxidovaných lipidů se zkráceným sn-2 řetězcem. Jejich vlivem v membráně vzrostla pohyblivost a hydratace v oblasti lipidových hlaviček. Tento efekt je ve shodě s molekulovými simulacemi, které ukázaly reorientaci krátkých sn-2 řetězců oxidovaných lipidů. Přítomnost oxidovaných molekul může také ovlivňovat difuzi lipidů v membráně, pozorovali jsme mírně zvýšený difuzní koeficient. Zkoumali jsme také vliv těžké vody na fosfolipidovou membránu. Přítomnost D2O způsobuje snížení pohyblivost a hydratace oblasti lipidových hlaviček, což je v souladu se simulacemi, které ukazují zvýšení dob života vodíkových vazeb mezi molekulami vody...

The thesis describes time dependent fluorescence shift method and fluorescence correlation spectroscopy method (FCS) with its extensions FLCS, Z-scan FCS and dual-focus FCS applied on specific problems in DNA and lipid research. Compaction mechanism of a DNA molecule smaller than a resolution of a confocal microscope was elucidated. The process was revealed to be "all or non" for a polycation spermine as a condenser in contrast with the gradual compaction caused by a cationic surfactant. Biophysical properties of a phospholipid bilayer influenced by presence of oxidized phospholipids with truncated sn-2 chain were explored. The dynamics of hydrated functional groups in the headgroup region was proved to get faster while the hydration of the headgroup region increased. These effects are in relation with the reorientation of the short sn-2 chains observed in molecular dynamics simulations. Presence of oxidized species may also influence the lateral diffusion of the lipids - a slight increase of the diffusion coefficient was observed. Decrease of hydration and mobility in the headgroup region was found as an influence of heavy water on the phospholipid membrane. These finding are in line with molecular dynamics simulations which show longer lifetimes of hydrogen bonds between water and lipid molecules in...