Využití diferenční skenovací fluorimetrie v charakterizaci vybrané karbonylreduktasy

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Radana Tomanová Školitel: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Název diplomové práce: Využití diferenční skenovací fluorimetrie v charakterizaci vybrané karbonylreduktasy Diferenční skenovací fluorimetrie (DSF) je jednoduchá a rychlá metoda, která umožňuje stanovit optimální podmínky pro stabilizaci proteinů a určit jejich ligandy. DSF sleduje tepelné rozvíjení proteinu v přítomnosti fluorescenční barvy (např. SYPRO oranž, 2,6-ANS). Barva je vysoce fluorescenční v nepolárním prostředí, jako jsou hydrofobní místa rozvíjejícího se proteinu, které se při postupném zvyšování teploty odkrývají na povrch. Teplota tání (Tm) proteinu vyjadřuje jeho stabilitu. Určení ligandů je založeno na skutečnosti, že s vazbou ligandu se zvyšuje stabilita proteinu (ΔTm > 0). Cílem této práce bylo metodu DSF zavést na našem pracovišti, použít ji pro charakterizaci karbonylreduktasy 1 (CBR1) a zhodnotit získané výsledky s nezávislými metodami a literaturou. Nejprve pomocí citrátsyntasy byla ověřena funkčnost metody a byly optimalizovány podmínky pro CBR1. K výběru optimálního prostředí pro screening ligandů CBR1 byla testována skupina několika pufrů pH 3-10 bez aditiv nebo s přídavkem NaCl nebo glycerolu. Dále byl měřen vliv...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Radana Tomanová Supervisor: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Title of diploma thesis: The use of differential scanning fluorimetry in characterization of selected carbonyl reductase Differential scanning fluorimetry (DSF) is simple, rapid method that enables to determine optimal conditions for stabilization of proteins and discover their ligands. DSF monitors thermal unfolding of a protein in the presence of fluorescent dye (e.g. SYPRO Orange, 2,6-ANS). The dye is highly fluorescent in non-polar environment such as hydrophobic sites of unfolded protein that appear on the surface in gradual increase of temperature. Melting temperature (Tm) of a protein expresses its stability. Ligand screening relies upon the fact that protein stability is enhanced upon ligand binding (ΔTm  0). The aim of this study was to introduce the DSF method on our department, use it for characterization of carbonyl reductase 1 (CBR1) and evaluate the obtained results with an independent methods and literature. First, the functionality of method was verified with citrate synthase and the conditions were optimized for CBR1. The group of several buffers pH 3-10 without additives or with NaCl or glycerol were tested...