HMGB1 při bakteriálních infekcích

Abstract

Bc. Petra Chmelařová Název diplomové práce: HMGB1 při bakteriálních infekcích Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Cíl práce: Stanovení aktivace genové exprese HMGB1 na úrovni mRNA a výskytu proteinu v krvi a v tenkém střevě při bakteriální infekci u infekčního modelu gnotobiotického selete. Zhodnocení průběhu infekčního procesu expresí IL-8, IL10, TNF-α a TLR4 v tenkém střevě na úrovni mRNA a IL-8, IL10 a TNF-α v krvi a střevním výplachu na úrovni proteinu. Výsledné posouzení HMGB1 jako možného pozdního markeru sepse u prasete. Metody: 1) Skupiny gnotobiotických selat - bezmikrobní (kontrola), infikovaná (extracelulární parazit E.coli O55 nebo intracelulární parazit Salmonella enterica sérovar Typhimurium) a asociovaná selata (probiotická E.coli Nissle 1917), 2) stanovení počtu CFU bakterií v krvi a střevě kultivací na bakteriologických půdách, 3) izolace celkové RNA ze střeva kolonkovou metodou, 4) spektrofotometrická kvantifikace a odhad čistoty celkové RNA, 5) syntéza cDNA metodou s kombinovanými primery (oligo d(T) a náhodné n-mery), 6) polymerázová řetězová reakce v reálném čase s LNA sondami, 7) normalizace genových přepisů k β-aktinu a jejich relativizace k průměrné hodnotě přepisu genu, 8) stanovení koncentrací HMGB1 a...

Bc. Petra Chmelařová Title of diploma thesis: HMGB1 in bacterial infections Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Background: Detection of HMGB1 mRNA expression and HMGB1 at the protein level in blood and ileum during bacterial infection in gnotobiotic piglet as infection model. Evaluation of the course of infection with expression IL-8, IL10, TNF-α and TLR4 mRNA in ileum and IL- 8, IL10 a TNF-α levels in blood and intestinal washes. Final assessment of HMGB1 as potential late marker of sepsis in pig. Methods: 1) The groups of gnotobiotic piglets - germfree (control), infected (extracellular parasite E.coli O55 or intracellular parasite Salmonella enterica serogroup Typhimurium) and associated piglets (probiotic E.coli Nissle 1917), 2) determination of bacterial count as CFU in blood and intestine with cultivation on bacteriological media, 3) column-based total RNA isolation from intestine, 4) spectrophotometric RNA quantification and estimation of purity, 5) cDNA synthesis with combined primers (oligo d(T) and random n-mers), 6) real-time polymerase chain reaction with LNA probes, 7) real-time PCR data normalization to β-actin and relativization to mean value of gene transcription, 8) ELISA detection of HMGB1 and selected...