The determination of clinically relevant proteins and screening for their inhibitors using DIANA method

Abstract

In drug discovery, high-throughput screening is often employed to evaluate thousands to millions compounds against clinically relevant enzymes. In this dissertation, the DNA-linked Inhibitor Antibody Assay (DIANA) was modified for four enzymes to enable effective, rapid, accurate, and reproducible inhibitor screening and/or target enzyme quantification. The targets included the cancer biomarker Fibroblast Activation Protein (FAP), influenza polymerase subunit PB2, influenza surface antigen neuraminidase (NA), and the immunoreceptor CD73. For FAP, screening of an FDA-approved compound library yielded 136 compounds with inhibitory activity, and the quantification of soluble FAP in human plasma using DIANA correlated with the enzyme activity assay. For PB2, DIANA and AlphaScreen methods were developed and the results were validated with the standard Differential Scanning Fluorimetry (DSF) method. Both assays allow high-throughput screening with low sample consumption. DIANA was further adapted for NA using oseltamivir derivatives to explore their binding in the "150-cavity", an allosteric site known to mutate, yielding resistant enzyme species. Finally, DIANA was applied to screen 5,280 compounds from the IOCB library against CD73. The screening identified two potent compounds bearing a...

Návrh a vývoj léčiv dnes často využívá vysoce výkonné testování tisíců až milionů látek proti různým klinicky významným enzymům. V této disertační práci byla modifikována metoda DNA-linked Inhibitor Antibody Assay (DIANA), zaměřená na čtyři enzymy, což umožnilo účinné, přesné a reprodukovatelné testování potenciálních inhibitorů a/nebo kvantifikaci proteinů. Mezi cílové proteiny patří nádorový biomarker Fibroblast Activation Protein (FAP), podjednotka PB2 chřipkové polymerasy, neuraminidasa (NA) viru chřipky a receptor CD73. Pomocí metody DIANA zaměřené na FAP byla testována knihovna sloučenin schválených FDA a bylo identifikováno 136 nových látek s inhibiční aktivitou. Dále byla touto metodou kvantifikována rozpustná forma FAP v lidské plazmě a výsledky korelovaly s testem enzymové aktivity. Metody DIANA a AlphaScreen byly navrženy pro testování inhibitorů podjednotky PB2 chřipkové polymerasy, přičemž výsledky obou metod byly ověřeny pomocí standardní metody (diferenční skenovací fluorimetrie). Tyto metody umožňují vysokokapacitní testování látek při nízké spotřebě všech reagencií. DIANA byla dále modifikována pro neuraminidasy, kde byly pomocí derivátů oseltamiviru zkoumány vazebné preference v takzvané "150-cavity", alosterického místa v blízkosti aktivního místa, důležitého pro vznik...