Molekulární mechanismus regulace funkce kaspasy-2 pomocí proteinů 14-3-3

Abstract

Molecular mechanism of 14-3-3 protein dependent regulation of caspase-2 Abstract Caspase-2 is a protease standing apically in the cascade of reactions leading to apoptosis. Properly functional apoptosis eliminates damaged cells, autoreactive lymphocytes or redundant groups of cells in ontogeny. The process of caspase-2 activation must be precisely regulated. One of the described ways of caspase-2 regulation causing its inhibition is posttranslational modification phosphorylation with subsequent binding of the regulatory scaffold protein 14-3-3. The aim of this dissertation is to explain the molecular mechanism of this regulation. To understand the interaction between the proteins, it was necessary to first identify the phosphorylation sites in the caspase-2 molecule recognized by the 14-3-3 protein and then describe the detailed structure of the binding complex. The structure was characterized by a number of biochemical and biophysical methods, such as analytical ultracentrifugation, native electrophoresis in TBE buffer, polarization-fluorescence assay, hydrogen/deuterium exchange coupled to mass spectrometry, or crystallization; and the results led to stimulating conclusions. Activation of caspase-2 begins with its binding to adaptor proteins, cleavage and dimerization of the catalytic subunits. The...

Molekulární mechanismus regulace funkce kaspasy-2 pomocí proteinů 14-3-3 Abstrakt Kaspasa-2 je proteasa stojící apikálně v kaskádě dějů vedoucích k apoptose. Správně vedený proces apoptosy likviduje poškozené buňky, autoreaktivní lymfocyty či nadbytečné skupiny buněk v ontogenezi. Proces aktivace kaspasy-2 musí být přesně regulovaný. Jedním z popsaných způsobů regulace kaspasy-2 způsobující její inhibici je posttranslační modifikace fosforylace spojená s následnou vazbou regulačního skafoldového proteinu 14-3-3. Cílem disertační práce je vysvětlit molekulární mechanismus této regulace. Pro porozumění interakce mezi proteiny bylo nezbytné nejprve určit fosforylační místa v molekule kaspasy-2 rozpoznávaná proteinem 14-3-3 a poté popsat detailní strukturu vazebného komplexu. Struktura byla popsána řadou biochemických a biofyzikálních metod, jako je analytická centrifugace, nativní elektroforesa v TBE pufru, polarizačně fluorescenční esej, vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií či krystalizace, a výsledky vedly k podnětným závěrům. Aktivace kaspasy-2 začíná její vazbou na adaptorové proteiny, štěpením a dimerizací katalytických podjednotek. Z výsledků vyplynulo, že protein 14-3-3 může svou vazbou inhibovat aktivaci kaspasy-2 skrze blokování sekvencí nezbytných pro dimerizaci a/nebo vazbu...