Regulation of microtubule dynamics revealed by single-molecule TIRF and IRM microscopy

Abstract

Mikrotubulární cytoskelet je rozmanitá bio-polymerní síť nezbytná pro život všech eukaryotních buněk. Mikrotubuly stochasticky přechází mezi fázemi polymerace a depolymerace. Tato dynamika je využívána buňkami ke generování sil nezbytných pro základní buněčné procesy, jako například buněčné dělení, motilita nebo morfogeneze. Regulace mikrotubulární dynamiky umožňuje buňkám adaptivně reagovat na změny podmínek. Molekulární mechanismy této regulace však nejsou zcela objasněny. V této práci jsme rekonstituovali dva mikrotubulární systémy, které jsme prozkoumali a popsali za použití kombinace TIRF mikroskopie s rozlišením na úrovni jedné molekuly a interferenční reflekční mikroskopie. (i) Zdvojené mikrotubuly, složené z kompletního mikrotubulu A s přisedlým mikrotubulem B, zajišťují strukturní stabilitu buněčných řasinek. I přes jejich fundamentální úlohu, není zatím znám molekulární mechanismus jejich formování. V této práci ukazujeme inhibiční roli C-terminální části tubulinu během tvorby zdvojených mikrotubulů. Zdvojené mikrotubuly jsme rekonstituovali pomocí částečného enzymatického štěpení mikrotubulů, následovaného přidáním volného tubulinu za přítomnosti stabilizačního činidla, čímž jsme objasnili dynamiku jejich vzniku. Ukázali jsme tedy, že inherentní vlastnosti tubulinu poskytují dostatečnou...

The microtubular cytoskeleton is a ubiquitous and highly diverse biopolymer network present in all eukaryotic cells. Microtubules stochastically alternate between phases of growth and shrinkage. Cells take advantage of this dynamicity to generate forces for essential processes, such as cell division, motility or morphogenesis. Regulating the microtubule dynamics enables cells to adaptively respond to a wide range of tasks and conditions. Molecular mechanisms underpinning the regulation are not fully understood. Using a bottom-up approach and the combination of single molecule total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and interference reflection microscopy (IRM), we here reconstituted and explored two dynamic cytoskeletal systems. (i) Microtubule doublets, comprising incomplete B-microtubule on the surface of a complete A- microtubule, provide an essential structural scaffold for flagella. Despite the fundamental role of microtubule doublets, the molecular mechanism governing their formation is unknown. We here demonstrate an inhibitory role of tubulin C-terminus in microtubule doublet assembly. By partial enzymatic digestion of polymerized microtubules followed by the addition of free tubulin in the presence of a stabilizing agent, we assembled microtubule doublets and revealed the B-...